Proje Özeti

TAGEM-18/AR-GE/30

“D-TAGATOZ 3-EPİMERAZ (D-TE) ENZİMİ ÜRETİMİ VE FRUKTOZDAN
ALLULOZ (PSİKOZ) ELDESİ”

TAGEM Araştırma Geliştirme Destek Programı kapsamında 2018 yılı 13. Proje Çağrı dönemimde desteklenen bu projenin amacı ve hedefi, rekombinant DNA teknolojisiyle D-tagatoz 3-epimeraz (D-TE) enziminin üretimi ve bu enzim kullanılarak kalori değeri yüksek olan Fruktozdan düşük kalorili tatlandırıcı ve dolgu maddesi olarak kullanılabilecek olan Alluloz (D-psicose) üretimidir.

D-TE üretimi rekombinant DNA teknolojisiyle gerçekleştirilecektir. Genomik DNA kaynağı olarak Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas cichorii ve/ya da Rhodobacter sphaeroides, konak hücre olarak Escherichia coli BL21 (DE3) ve ekspresyon vektörü olarak pET 24a(+) ve pET 22b(+) plazmid vektör kullanılacaktır. Bu amaçla, enzim genini DNA’sında bulunduran A. Tumefaciens LB (Luria Bertani) besiyerinde, R. Sphaeroides ise Van Niel’s Yeast Agar (1 g K2HPO4 + 0.5 g MgSO4 + 10 g yeast extract + 20 g Agar + 1000 ml distile su) besiyerinde geliştirilecek ve PCR temelli yöntemler kullanılarak DNA’ları izole edilecektir. DNA izolasyonu için, geliştirilen bakteri hücrelerinden ayrı ayrı 2-3 öze dolusu alınarak 1.5 ml’lik steril eppendorf tüplerine alınacaktır. DNA izolasyonu, ticari izolasyon kiti (Qiagen) kullanılarak gerçekleştirilecektir. Her bir mikroorganizma için, konakçıdan elde edilen DNA ve kullanılacak plazmid aynı restriksiyon enzimleriyle kesilerek, DNA’nın plazmide yerleşmesi sağlandıktan sonra oluşan rekombinant DNA E. Coli BL21 (DE3) hücrelerine transfer edilecektir. E. Coli BL21 (DE3)’ten ampicillin içeren LB agara ekim yapılarak rekombinant DNA içeren hücrelerin çoğalması sağlanacaktır.

Fruktozdan alluloz üretiminde ise, %99 veya daha yüksek saflıkta kristal haldeki fruktoz hammadde olarak kullanılarak öncelikle %50’lik fruktoz çözeltisi hazırlanacaktır. Bu çözelti, D-tagatoz 3-epimeraz enzimi ve/yada bu enzimi içeren canlı olmayan miroorganizma tutuklanarak doldurulmuş biyoreaktörden geçirilerek bu enzim yardımıyla fruktoz alluloza dönüştürülecektir. Fruktozun alluloza dönüşüm miktarı ve saflık değeri HPLC-RID sistemi ile tespit edilecektir.

Biyoreaktörden fruktoz+alluloz şeklinde elde edilen karışıma ekmek mayası (Saccharomyces cerevisiae) ilave edilerek kalan fruktoz fermantasyona uğratılacak ve alluloz çözeltisine, aynı miktarda etanol ilave edilerek alluloz kristalleri elde edilecektir.

Alluloz üretimiyle, hem çok ucuz bir hammadde olan fruktoz ekonomik değeri yüksek olan alluloza dönüştürülerek ekonomiye katkı sağlanacak, hem de yüksek konsantrasyonlarda  frutoz şurubu (HCFS) tüketiminde karşılaşılan birçok sağlık sorununun önüne geçilecektir. Üretilecek olan alluloz düşük kalorili tatlandırıcı ve dolgu maddesi olarak gıda maddelerinin üretiminde güvenle kullanılabilecektir.

Ayrıca bu çalışmada alluloz üretimi için gerekli olan ve Dünyada ticari olarak üretimi ve satışı bulunmayan D-TE enziminin Ülkemizde üretimi gerçekleştirilmiş olacaktır.